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两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)

简要描述:两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)是整合 cDNA 第一链合成试剂和即用型 PCR 试剂而得的 RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和PCR 反应分别在两个离心管中进行。

  • 更新时间:2024-06-28
  • 厂商性质:生产厂家
  • 生产地址:上海
  • 访  问  量:922

详细介绍

品牌YLKBIO货号YLK10360P
规格50T供货周期现货
主要用途科研实验应用领域化工,生物产业
英文名称Two-Tube RT-PCR Kit运输:低温运输
保存条件:-20℃有效期:12个月
自备试剂样品 RNA、模板专一正向和反向引物

两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)说明书

中文名称:两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq

英文名称:Two-Tube  RT-PCR KitAMV-Taq

本试剂盒是整合 cDNA 第一链合成试剂和即用型 PCR 试剂而得的 RT-PCR 试剂盒。cDNA 第一链合成反应和PCR 反应分别在两个离心管中进行。

规格及成分:

成分

50次塑料袋包装

RT试剂盒

50

即用型PCR试剂盒

9 ml

使用手册

1

 

 

 

 

 

RT试剂盒成分表:

RT试剂盒成分

50次包装

MMLV逆转录酶(含RT)

100 ul

RTBuffer (含dNTP)

300 ul

OligodT)18引物(0.5ug/ul

50 ul

随机引物(0.2ug/ul

50 ul

RNase-free 

10 ml

 

 

 

 

 

 

 

即用型 PCR 试剂盒成分表:

即用型PCR 试剂盒 3.0 成分

600 次包装

PCR MagicMix 3.0

9 mL

专用染料

360 uL

 

 

 

 

两管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)具有以下特点:

1.即开即用,足够 50  RT 反应(20 uL 体系) 600 PCR 反应(30 uL 体系

2.cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物,适合各种情况。

3.PCR 试剂盒具有即用、简单等优点,PCR mix 中含上样染料,所以 PCR 产物可以直接上样电泳。

4. 两管式操作,RT PCR 在不同试管中进行,便于单独优化 RT 反应或PCR 反应条件。

5.扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA

 

运输及保存

低温运输,-20保存, 有效期一年。

自备试剂

样品 RNA、模板专一正向和反向引物。

使用方法:

一、样品 RNA 的制备(本试剂盒不提供相关试剂)

可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA,也可以选用其他供应商的产品,但得到的 RNA 一定要溶解在RNase-free 的超纯水中。

二:RT(逆转录)反应合成 cDNA

1.按下表配制 RT 反应体系(20 uL 体系):

 

RNA 模板


RNA

100-500 ng

 poly(A) mRNA

10-500 ng

或专一的   RNA(如体外转录制备的)

0.01 pg-500 ng

引物


Oligo (dT)18(0.5 ug/uL)

1 uL

或随机引物(0.2 ug/uL)

1 uL

或自备模板专一反向引物(10 pmol/uL)

1-2 uL

RNase-free 

补水到 12   uL

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

注意:RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度(成反比)。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物,但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA(只占 5%左右),则可优先选用 OligodT 引物,这样就可以排除非mRNA 的干扰。

2.70保温 5 分钟变性模板后立即冰浴。

3.按顺序加入 6 uL RT Buffer(含 dNTP)和 2 uLMMLV 逆转录酶(含 RI),反应终体积为 20 uL

4.42保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

5.70保温 10 分钟以终止反应,然后放置在冰上待用。

6.合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用,不需要纯化。剩余样品可以放置在-20长期保存。

三、PCR30 uL 体系)

1、将全部专用染料加入到PCR MagicMix 3.0 中,轻柔颠倒混匀即可使用。未用完的部分需要在-20。也可以不加专用染料,但在 PCR 结束后,电泳上样前,则需要加入电泳上样液,否则电泳时没法判断电泳速度。

2、在 PCR 管中加入下列成分:

成分

加入量

PCR MagicMix 3.0(已加染料)

15 uL

cDNA 样品(上步的 RT 反应液)

1-5 uL

模板专一性正向引物(10 pmol/uL)

1-2 uL

模板专一性反向引物(10 pmol/uL)

1-2 uL

补水到

30 uL

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

注意:cDNA 也可以稀释后用作 PCR 模板。是否稀释或稀释多少倍wan全取决于靶基因的丰度。

PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定,下面的只做参考)

过程

温度

时间

预变性

94℃

5min

PCR反应

35个循环)

94℃

1min

55℃

1min

72℃

2min

最后延伸

72℃

10min

 

 

 

 

 

 

 

 

四、电泳检测

1、取 5-0 uL PCR 产物直接在PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳,跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注:本试剂盒中的PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上样,不需要

额外再加电泳上样液。

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