羟自由基清除能力测定试剂盒说明书
微量法100T/96S
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
羟自由基作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子,造成细胞结构和功能受损,进而导致体内代谢紊乱引起疾病。羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一,在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
测定原理:
H2O2/ Fe2+ 通过Fenton反应产生羟自由基,将邻二氮菲- Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3+ ,导致536nm吸光度下降,样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度,反映了样品清除羟自由基的能力。
自备实验用品:
恒温水浴锅、酶标仪、96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体100 mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体12mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体6mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体12 mL×1瓶,4℃保存。
试剂四:液体6mL×1瓶,4℃保存。
样品的制备:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 血清、果汁等液体样品可直接测定。
3. 提取物(或者药物)可配制成一定浓度,如5 mg/mL。
操作步骤:
1、 酶标仪预热30min,调节波长至536nm。
2、 工作液配制:使用之前按照每管试剂一:试剂二:试剂三=100:50:100(µL)的比例配制,用多少配多少,混匀。
3、 在EP管中加入如下试剂
空白管 | 对照管 | 测定管 | |
工作液(µL) | 250 | 250 | 250 |
混匀,防止局部颜色过浓 | |||
样品(µL) | 50 | ||
试剂四(µL) | 50 | 50 | |
H2O(µL) | 100 | 50 | |
混匀,37℃保温60min,8000g 25℃离心5min,吸取200μL于96孔板中测定536nm处吸光值,空白管、对照管和测定管的吸光值分别记为A空、A对和A测。 |
注意:空白管和对照管只需测定一次。
计算公式:
羟自由基清除率 D% =(A测-A对)÷(A空-A对)×100%
A空、A对、A测:空白管、对照管和测定管的吸光值。
注意事项:
为了比较不同样品羟自由基清除能力,对于同一批样品必须加入等量的样品,血清、组织匀浆、果汁等液体样品加入同样体积,提取物(或者药物)配制成同样浓度。